免疫共沉淀(Co-IP蛋白与蛋白)

免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用

的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被

裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，

那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上

的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合，也可用于确定

一种特定蛋白质的新的作用搭档。

Co-IP的原理与免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)大致相似，都由特异抗体与待检样品中相应的特异抗原结合

形成抗原一抗体免疫复合物，然后复合物吸附于固化了蛋白A或G的支持物上(蛋白A或G具有吸附抗体的能力)，

相应的抗原分子也同时被吸附。免疫复合物被吸附到支持物上的过程即为沉淀(Precipitation)。没有被沉淀的

蛋白质随着缓冲液的流洗而被除去。但在免疫共沉淀中，与靶抗原一起被沉淀的还有靶抗原的相互作用蛋白质，

即随着抗体被吸附于固化了蛋白A或G的支持物上，相应的抗原及其相互作用蛋白质也同时被沉淀。最后，采用

相互作用蛋白质的特异抗体经Western Blot检测，以证实二者存在相互作用。

实验方法：

（1）转染后24-48 h 可收获细胞，加入适量细胞裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30min, 细胞裂解液

于4°C，最大转速离心30 min后取上清；

（2）取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液，4℃缓慢摇晃孵育过夜；

（3）取10μl protein A 琼脂糖珠，用适量裂解缓冲液洗3 次，每次3,000 rpm离心3min；

（4）将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4℃缓慢摇晃孵育2-4h，使抗体与

protein A琼脂糖珠偶连；

（5）免疫沉淀反应后，在4℃以3,000 rpm 离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1ml

裂解缓冲液洗3－4次；最后加入15μl的2×SDS 上样缓冲液，沸水煮5min；

（6）SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析,通过免疫共沉淀确定结合蛋白。

实验流程：

1．用磷酸盐缓冲液洗30块10 cm培养板上的适宜细胞。刮去每块板上的细胞到1 ml冰冷的EBC裂解缓冲液中。

2．将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中，在微量离心机上4℃以最大速度离心15 min。

3．收集上清（约30 ml）并加入30μg的适当抗体，4℃摇动免疫沉淀物1 h。

4．加入0.9 ml的蛋白A-Sepharose悬液，4℃摇动免疫沉淀物30min。

5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重复洗5次,最后用NETN洗一次。

6．吸出混合物的液体部分,加入800μl的1×SDS胶加样缓冲液到球珠中，煮沸4min。

7．将样品加入到大孔的不连续SDS-PAGE梯度胶中，在10 mA的恒定电流下电泳过夜。

8．通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带。

9．从胶上切下目标带，将其放到微量离心管中，用1ml 50%乙腈洗两次，每次3 min。

10． 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质，再将肽电洗脱。

11． 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在ABI 477A或494A机器上进行自动Edman降解测序。

注意的问题：

（1）细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质－蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂

（NP40 或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定,不能用高浓度的变性剂（0.2％SDS)，

细胞裂解液中要加各种酶抑制剂

（2）使用明确的抗体，可以将几种抗体共同使用

（3）使用对照抗体，单克隆抗体用正常小鼠的IgG或另一类单抗，兔多克隆抗体用正常兔IgG

在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性，应注意以下几点：

(1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的，而并非外源非特异蛋白，单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生；

(2) 要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀；

(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。

结果内容：整理好的报告