OneStep® Ahead RT-PCR Kit

 OneStep® Ahead RT-PCR Kit

The OneStep Ahead RT-PCR Kit (cat. 220213) should be stored immediately upon receipt at –30 to –15°C in a constant-temperature freezer. The OneStep  Ahead  RT-PCR  Master  Mix  can  also  be  stored  at  2–8°C  for  up  to  6  months, depending on the expiration date.

Notes before starting

. Reverse transcription and PCR are carried out sequentially in the same tube. All

components required for both reactions are added during setup, and there is no need to add additional components once the reaction has been started.

. The protocol has been optimized for 0.1 pg –  1 μg of total RNA.

. The blend of DNA polymerases, including a proofreading enzyme, contained in the

QIAGEN OneStep Ahead RT-PCR Master Mix, requires a heat-activation step of 5 min at 95°C after the reverse transcription step. This also inactivates the reverse transcriptases.

. The OneStep Ahead RT Mix contains an RNase inhibitor and a blend of Omniscript® and Sensiscript®  reverse transcriptases in combination with an RT-blocker for heat-mediated     activation of the reverse-transcription step.

. Heat-mediated activation of the reverse transcriptases prevents nonspecific enzyme

activity. This allows reaction setup at room temperature, facilitating the use of this kit in automated (robotic) workflows.

. The kit is designed for use with gene-specific primers at a final concentration of 0.5 μM. The use of random oligomers or oligo-dT primers is not recommended.

. QIAGEN OneStep Ahead RT-PCR Buffer provides a final concentration of 2.5 mM MgCl2 in the reaction mix, which provides satisfactory results in most cases.

. The OneStep Ahead Template Tracer and the OneStep Ahead Master Mix Tracer contain blue and orange dyes, respectively, that allow tracking of pipetted samples during RT-

PCR setup. The use of these tracers is optional. When the blue template is added to the   orange OneStep Ahead RT-PCR Master Mix, the color changes to green. The Template    Tracer is provided as a 25x concentrate and should be used in a 1x final concentration  in the sample. To generate a template dilution series, dilute the 25x concentrate (using    template and water) to obtain a final concentration of 1x OneStep Ahead Blue Template Tracer in the diluent. The Master Mix Tracer is provided as a  125x concentrate and can be added directly to the Master Mix stock vial to obtain a  1x concentration in the final    reaction mix. These tracers do not reduce sample stability or RT-PCR performance.

. Reactions can be directly loaded onto an agarose gel after cycling. Tracer dyes allow  monitoring of the loading process and tracking during subsequent electrophoresis. The dyes run at approximately 50 bp (orange) and 4000 bp (blue) on a  1% agarose gel.

. The QIAGEN OneStep Ahead RT-PCR Kit contains Q-Solution®, which facilitates

amplification of templates that have a high degree of secondary structure or that are GC- rich. When using Q-Solution for the first time with a particular primer–template system,     always perform parallel reactions with and without Q-Solution.

1.  Thaw OneStep Ahead RT-PCR Master Mix,  template RNA, primer solutions,   RNase-free water and 5x Q-Solution (optional). Mix thoroughly before use.

2.  Prepare a reaction mix according to Table 1. The reaction mix contains all the

components except the template RNA. Prepare a volume of reaction mix 10% greater than that required for the total number of reactions to be performed.

Due to the 2-phase hot-start of both the RT and the PCR reactions, it is not necessary to keep samples on ice during reaction setup or while programming the cycler.

Note: A negative control (without template RNA) should be included in every experiment.

Table 1. Reaction setup for one-step RT-PCR

* For templates with GC-rich regions or complex secondary structure.

3.  Mix the reaction mixture gently but thoroughly, for example, by pipetting up and down a few times or vortexing a few seconds. Dispense appropriate volumes into PCR tubes or     wells of a PCR plate.

4.  Add template RNA (1 μg –  100 fg per reaction, depending on target transcript

abundance) to the individual PCR tubes. The QIAGEN OneStep Ahead RT-PCR Kit can be used with total RNA, messenger RNA, viral RNA or in vitro transcribed RNA.

5.  Program the thermal cycler according to the manufacturer’s instructions, using the  conditions outlined in Tables 2 and 3. The protocol includes steps for both reverse transcription and PCR.

6.  Place the PCR tubes or plates in the thermal cycler and start the RT-PCR program. Note: After amplification, store samples at –20°C for long-term storage.

7.  We have evaluated several specialized protocols and particular hints.